Метаболитното манипулиране се определя като пренасочване на една или повече ензимни реакции с цел синтез на нови за организма компоненти, подобряване биосинтетичните процеси или предизвикване биодеградация на съществуващи в организма метаболити. В светлината на 25-годишното развитие на растителното метаболитно манипулиране е важно да разберем, че това е една доста млада наука. Информацията ни за взаимовръзката "субстрат-продукт" в растителните метаболитни пътища значително се увеличи след 1975 година, вследствие прилагането на радиоактивни изотопни маркери. Опитите да се използва това знание за манипулиране на метаболизма в растенията обаче бяха ограничени от развитието на основни молекулярно-биологични технологии като клониране, промоторен анализ, белтъчно белязване, растителна трансформация, биохимична генетика и други области от растителната биология. Въпреки това забавяне, значителен прогрес бе постигнат в средата на 80те години по отношение на молекулярните изследвания на много растителни метаболитни пътища и на използването на генно клониране за манипулиране на тези пътища. Mежду успешните разработки обаче имаше и голям брой изследвания, чиито резултати бяха напълно непредвидени. Такива данни подчертват откъслечните ни знания за растителния метаболизъм и растящата разлика между способността ни да клонираме, изучаваме и манипулираме отделните гени (белтъци) и нашето разбиране на тяхната интеграция и влиянието им върху цялостната метаболитна мрежа в растенията. С откриване на 100000 уникални компонента, продуцирани в растителното царство, определянето на метаболитните мрежи се превръща в голямо предизвикателство. Примерите, дадени в тази статия, имат за цел да подчертаят някои въпроси, възникнали в областта на метаболитното манипулиране, да илюстрират напредъка и същевременно ограниченията в досегашните изследвания и да осигурят перспективна гледна точка в тази интересна област на растителната биология през следващите години.

Технологичният напредък в генетиката подпомогна развитието на метаболитното манипулиране

Зависимостта на растителното метаболитно манипулиране от технологичния напредък е много ясно изразена в изследванията на липидния метаболизъм. Въпреки че бяха изучени доста стъпки в растителния метаболизъм на биохимично ниво през 70те години, в ранните 80 години прогресът в изолирането, пречистването и клонирането на много метаболитни ензими и специално мембранно-асоциираните бе забавен от биохимични трудности, свързани с мишенните ензими. Голяма крачка напред бе направена с генетичното определяне на ензимите в този синтетичен път при Arabidopsis (2). Това напредничаво изследване в областта на растителната биохимична генетика бе моделирано въз основа на мутации, направени с цел да се изучи метаболизма в бактериална система. По-ранни работи на Somerville и сътрудници, изучаващи фотодишането на Arabidopsis, доказаха надеждността на биохимичната генетика при изучаване на растителния метаболизъм (24). Повече от 10000 мутанти Arabidopsis бяха изследвани чрез газова хроматография за изменени мастни киселини, с цел изясняване на липидния синтез. Резултатите, получени при идентификацията на серия нови информативни мутации, определящи стъпки от биосинтетичния липиден път, позволяват да се развият и тестват генетичните модели на плазмидните и екстраплазмидните пътища (2). Същите мутанти осигуряват генни мишени за последващо клониране на известен брой гени чрез разходка по хромозомите (chromosome walking), Т-ДНК маркиране, и други хомоложно базирани подходи (18). Изясняването на биосинтеза на растителни компоненти от други класове като аминокиселини, восъци, антоциани и аскорбинова киселина, беше развито въз основа на подобни молекулярно-генетични разработки (5,6,13,19,20).
Друг пример за влиянието на технологията върху откриване на кодиращите гени и метаболитното манипулиране произлиза от изследвания на каротеноидния биосинтетичен път. Въпреки че този път е известен още в средата на 60те години, лабилните, мембранно-свързани ензими остават рекалцитрантни, недостъпни за изолиране и изучаване. Каротеноидите обаче се синтезират също и от много фотосинтезиращи и нефотосинтезиращи бактерии. Развитието на молекулярно-генетичните техники при прокариоти през 80те години позволи на учените да получат достъп до техните гени, свързани с каротеноидния биосинтез. Използването на прокариотни системи даде възможност за клониране на повечето каротеноидни биосинтетични ензими през 90те (7).
Един от основните подходи, използващи мутантни последователности за идентифициране и изолиране на каротеноидни биосинтетични гени, бе основан на резистентността им към специфични хербициди. Първият успех бе клонирането на фитоендесатураза (ФДС) от цианобактерията Synechococcus - PCC7942 (4). Бяха селектирани мутанти, резистентни към хербицид, който инхибира ФДС и мутантна ДНК библиотека бе внедрена в див тип Synechococcus. Мутантният ФДС ген бе идентифициран чрез способността му да придаде хербицидна резистентност на дивия тип. Еволюционните взаимоотношения между цианобактерии и растения позволиха да се изолират и растителни гени, съответни на ФДС от няколко вида растения. Бе използван и втори подход, наречен цветна комплементарност. Каротеноидно-биосинтетични гени от бактериални, гъбни и растителни източници се внедряват в плазмид, предназначен за експресия от Escherichia coli, която в норма няма ендогенни каротеноидни и асоциирани с тях ензими. В зависимост от това кой ген и етап от метаболитния път е манипулиран, се акумулират различно оцветени метаболити. Внедряването на растителни копиДНК библиотеки в реципиенти като E.coli позволява функционална идентификация на копиДНКи (понякога до няколко стотици хиляди), кодиращи следващия ензим в биосинтетичния път, въз основа на промяна в цвета на каротеноидния продукт. Подобни стратегии, използващи хетероморфни системи, също позволяват функционално базирано клониране на ензими от биосинтетичния път на растенията като стероли, аминокиселини и витамини (11, 20, 22, 23).

Предвиждане на резултата от метаболитното манипулиране е една предизвикателна задача

Въпреки впечатляващия прогрес при идентификацията на гени и манипулиране на тяхната експресия в трансгенни растения през последните две десетилетия, опитите да се използват тези техники за манипулиране на растителния метаболизъм имаха по-ограничен успех. Повечето експерименти в метаболитното манипулиране бяха фокусирани върху повлияване експресията (позитивно или негативно) на един единствен ген, контролиращ даден метаболитен път. В общи линии способността да се предвидят експерименталните резултати бе много по-добра, когато се цели изменение на съществуващ компонент в сравнение с опитите да се увеличи потока през даден метаболитен път. Модификациите на запасни вещества или на компоненти на вторичния метаболизъм, който често има относително изменчива роля в растителния организъм, също имаха по-добър успех, отколкото тези при първичния и междинния метаболизъм (16, 26). Следват няколко кратки примера.
Биосинтезът на липиди бе един от първите метаболитни пътища, използван за манипулациите, както бе и при случая с генното идентифициране. Той представлява един от най-добрите примери за манипулиране на растителния метаболизъм и до днес. Повечето гени, свързани с ензимите синтезиращи мастни киселини бяха клонирани. Различни академични и индустриални групи модифицираха тяханата експресия, за да повлияят мастно-киселинната композиция на маслодайните семена. Пространството тук ни позволява да обсъдим само един пример. Препоръчваме на читателя за по-подробна информация по въпроса да се обърне към статията на Somerville, Boneta Plant Physiol., Jan 2001, Vol 125: 168- 171. Манипулирането на соя и рапица бе осъществено, защото техните масла съдържат големи количества линоленова киселина (18:2), която е чувствителна към окисление и ограничава тяхната трайност и използваемост. Чрез антисенс инхибиция на олеат (18:1) десатураза се получи масло, което съдържа повече от 80% олеинова киселина (мононенаситена мастна киселина) и значително намалени количества полиненаситени мастни киселини (12). Мононенаситените мастни киселини са по-устойчиви на окисление. Те са по-здравословни компоненти в човешката диета в сравнение с полиненаситените и представляват чудесен пример за ранните етапи в практическото приложение на растителното метаболитно манипулиране.
През последните години бяха успешно осъществени опити и в други области на метаболитното манипулиране, обещаващи ползи за човешкото здраве (8). Например последният ензим в биосинтезата на a-токоферол - g-токоферолметилтрансфераза (g-TMT) бе използван за увеличване активноста на витамин Е в семена от Arabidopsis. Arabidopsis, като повечето маслодайни култури, съдържа големи количества g-токоферол, който има 10% от витамин Е активността на a-токоферол. Експресията на g-TMT в Arabidopsis причини превръщането на голям пул g-токоферол в a-токоферол, придружено от десетократно увеличаване активността на витамин Е. Осъществяване на подобно превръщане в култури като соя, рапица и царевица ще увеличи нивата на този важен антиоксидант/витамин в храната и евентуално ще има забележителни резултати при подобряване здравето на населението. Например наскоро бе манипулирано съдържанието на b-каротен (провитамин А) в ендосперм от ориз. Дефицитът на витамин А е сериозен проблем в "третия" свят. Оризът е основна хранителна суровина в развиващите се страни, но е беден източник на много от основните витамини и минерали, включително на b-каротен (провитамин А). Манипулиране нивата на b-каротен в ориза е възможно благодарение идентификацията на каротеноидно-биосинтетични гени чрез моделна система, описана по-горе. Три такива гена (два растителни и един бактериален) бяха манипулирани за едновременна експресия в оризов ендосперм. В резултат първото поколение от този трансгенен ориз даде жълт ендосперм (така наречения "златен ориз"), съдържащ b-каротен, който може да осигури 10% от препоръчваната дневна доза чрез приемането на усреднени дневни количества ориз.Чрез последващи манипулации може да се достигне препоръчваната дневна доза витамин А. Това е потенциална възможност да се избегне дефицитът му в световен мащаб.
Изправяйки се пред новите експериментални възможности, които молекулярните, генните и трансгенни технологии предоставиха през последните две десетилетия, учените биха могли да се изкушат да фиксират вниманието си върху производството на трансгенни растения и да изгубят оценката си за важната роля, която играе ензимната кинетика, както в индивидуалната реакция, така и в целия метаболитен път. Резултати от внимателно разглеждане на ензимната кинетика в метаболитното манипулиране бяха елегантно демонстрирани в изследване, посветено на модифициране синтеза на скорбяла, чрез манипулиране на АДФ-глюкозопирофосфорилаза (АДФГПФ). Растителната АДФГПФ е чувствителна към алостерични ефектори и бе определена като ключов регулатор на скорбелния биосинтез. АДФГПФ, изолирана от Escherichia coli, е свързана със синтеза на гликоген и също е чувствителна към алостерични ефектори. Мутации в алостеричната регулация причиняват увеличение на гликогеновите нива в E. coli. Stark и сътрудници (25) въведоха АДФГПФ от див и мутантен тип E. coli за експресия в растения и анализираха ефекта от акумулацията на скорбяла. Домат, трансформиран с АДФГПФ от див тип E. coli има нива на скорбяла, не по-високи от тези на диво растение, докато растенията, трансформирани с алостерично нечувствителнa E. coli АДФГПФ, съдържат 60% повече скорбяла. Този ефект се наблюдава само при мутантни белтъци в хлоропластите, притежаващи специфичен промотор; конституционната експресия е летална. Тези резултати демонстрират необходимостта от внимателно обмисляне на мишенната тъкан, субклетъчната локализация и ензимната кинетика при манипулиране на растителния метаболизъм.
Опитите за манипулиране на съдържанието на лизин в семена (Lys е аминокиселина, която служи за запасно вещество в семената), илюстрират нуждата от зачитане както на катаболитните, така и на анаболитните вариации при манипулиране на определени метаболитни фенотипове в растенията. Една от ключовите стъпки в биосинтеза на лизин се осъществява от дихидродипиколинатсинтаза, която се инхибира на принципа на обратната връзка от продукта - лизин. Така се контролира потокът през този метаболитен път. При въвеждане на нечувствителна бактериална дихидродипиколинатсинтаза, подобно опитите с АДФГПФ, описани по-горе, се увеличава потокът през биосинтетичния път на лизин. В повечето случаи обаче това не причини стабилно увеличение на лизиновите нива. Този ефект се получи в растения, при които увеличаването на потока доведе до насищане на ензима, катализиращ първата стъпка от катаболитния път.
Манипулацията на лимитиращите ензими от първичния въглероден метаболизъм, целяща да се изучи ролята им в регулацията на метаболитния поток, ни осигури един от най-изненадващите резултати в метаболитното манипулиране (26). Тези експерименти ни наведоха на мисълта, че задълбоченото разбиране на индивидуалните кинетични характеристики на ензимите носи по малко информация, отколкото изясняване на ролята им в цялостния метаболитен път. Потенциалните регулаторни ензими по принцип се идентифицират на базата на катализираните от тях обратими реакции, подходящи ензимни ефектори или чрез традиционни биохимични белези. Когато активността на стриктно регулирани ензими от цикъла на Калвин като фруктозо-1-транскетолаза, 6-бифосфатаза и фосфорибулозокиназа, бе редуцирана 3 и 10 пъти, се отчете изненадващо малък ефект върху фотосинтетичното ниво. За разлика от това, минимално инхибиране на плазмидна алдолаза, която катализира обратима реакция, и не е обект на алостерична регулация, доведе до значително намаляване на фотосинтетичните нива и на въглеродното разделяне. Оказва се, че алдолазата, която на пръв поглед не е свързана с регулацията на потока през метаболитния път, има голямо влияние върху него. Подобни изненади бяха разкрити при манипулация на предполагаемите регулаторни ензими от гликолизата. Такива данни поставиха под въпрос много от дългогодишните ни представи за регулацията на метаболитния поток и ни принудиха да преоценим индивидуалната роля на ензимите в този процес. Тези разработки изясниха и необходимостта от обмислено прилагане на индивидуалната ензимна кинетика при контролиране на потока през метаболитните пътища.

Транскрипционните регулатори дават възможност за манипулация на целия метаболитен път

Дотук обсъждахме манипулирането на структурни гени за метаболитни ензими, с цел повлияване на растителния метаболизъм. Интересен подход за метаболитно манипулиране, увеличаващ знанията ни за координиране промените в генната експерсия, необходим за регулация на целия метаболитен път е идентифицирането и изучаването на транскрипционните фактори, контролиращи отделните метаболитни клонове (14, 15, 17, 28). Много от транскрипционните регулатори, влияещи на растителната биохимия и развитие, бяха идентифицирани чрез химично или транспозонно базирани мутации в царевица, кученце (Antirrhinum) или Arabidopsis. Клонирането на такива локуси осигури възможност за използване на тези гени при манипулиране на растителната биохимия в титулярния организъм или в други растения. Един от ранните примери за използване на този подход, бе манипулиране на Arabidopsis с цел експресия на транскипционни фактори в царевица - C1 и R, които регулират продукцията на антоциани в алейроновия слой (17). Едновременната експресия на C1 и R от силен промотор причинява масивно акумулиране на антоциани в Arabidopsis, вероятно чрез активиране на целия метаболитен път. Наскоро царевичните транскипционни фактори C1, R и P бяха експресирани в клетъчни култури. Бяха анализирани ефектът им върху антоциановата биохимия и глобалната генна експресия. По този начин, бе създадена една нова гледна точка за антоциановия метаболитен път, неговата регулация и мишените на тези регулаторни гени. Такива експерименти с експресията биха могли да позволят определяне на транскипционните регулаторни мрежи за биохимичните пътища.

Слона, слепеца и едно кратко потапяне в метаболитния пул

Тази статия е прекалено кратка, за да може да покрие повечето аспекти на метаболитното манипулиране през последните 25 години. Достатъчно е обаче, да кажем, че това беше един изключително вълнуващ четвърт век, който подготви сцената за революция във възприемането ни на метаболизма и метаболитното манипулиране на растенията. Скоростта на откриване на гени, свързани с растителния метаболизъм, се увеличи драматично през последните десетилетия. Тя ще се увеличава още през следващите години, благодарение публикуването на експресирани маркерни последователности и цели геноми, които ще позволят на изследователите с лекота да пренасят метаболитни пътища между организмите и през еволюционното време. През последните 15 години се усъвършенства и способността ни да индуцираме промени в генната експресия на трансгенни растения до степен, в която манипулациите са адресирани до точно определена тъкан и етап на развитие. Въпреки това, през този период способността ни да анализираме глобалните ефекти на тези манипулации върху метаболизма не беше на необходимото ниво. Подобно на слепеца, който може да докосне само малка част от слона, много често и ученият бе способен да "види" само частица от звяра, когото наричаме метаболизъм.
Добрата новина е, че технологията продължава да носи обещания за бързо развитие на растителното метаболитно манипулиране. Днес ние сме способни да анализираме последствията от генните или трансгенни изменения в експресията на десетки хиляди гени едновременно. С развитието на протеомиката, ще бъдем способни да определяме нивата на много белтъци едновременно и да следим посттранслационните изменения, които настъпват. Това, от което се нуждаем сега, е аналитичен метод за подреждане и изясняване на глобалните ефекти от манипулирането върху ензимните активности, метаболитите и техните потоци. Ядрено-магнитният резонанс и изграждането на метаболитен профил са едни от основните кандидати, които биха могли да запълнят тази ниша (21, 27). Интегрирането на глобалните анализи, от транскипцията до метаболитите, може най-накрая да ни позволи да видим слона в цялото му великолепие! Със сигурност това е доста амбициозна задача, но е необходимо само да си припомним прогреса на ДНК секвенирането през последните 25 години, за да осъзнаем, че всичко е възможно.